Лаборатория хроматографии

Группа хроматомасс-спектрометрии


Слева направо: студ. Федорова Е.С., асп. Стекольщикова Е.А., к.х.н. Ставрианиди А.Н., асп. Байгильдиева Д.И., асп. Плющенко И.В., к.х.н. Байгильдиев Т.М., д.х.н. Родин И.А.)

Основные направления исследований
Разработка новых ВЭЖХ-МС/МС способов обнаружения и определения продуктов деградации двух основных классов отравляющих веществ (нервно-паралитических и кожно-нарывных) в объектах окружающей среды и биологических материалах для установления факта применения, разработки, утилизации или хранения химического оружия. Разработка ВЭЖХ-МС и ГХ-МС способов обнаружения, идентификации и определения малых молекул, в том числе физиологически активных. Создание способов хроматографического профилирования объектов растительного и биологического происхождения и обработки данных.

Объекты исследования
Объекты окружающей среды, лекарственные препараты, биологические жидкости, напитки и продукты питания, растительные материалы и продукты на их основе.

Методы исследования
Группа занимается развитием методов обращенно-фазовой ВЭЖХ, ГХ, гидрофильной и ионной хроматографии а сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в варианте МС/МС и масс-спектрометрией высокого разрешения. При разработке новых подходов к определению малых молекул в сложных объектах широко используются различные способы пробоподготовки, включая дериватизацию.

Достигнутые результаты
Разработаны новые подходы для определения конечных продуктов трансформации нервно-паралитических отравляющих веществ.

Алкилметилфосфоновые кислоты (АМФК), а также метилфосфоновая кислота (МФК) являются продуктами деградации нервно-паралитических отравляющих веществ (НПОВ) в объектах окружающей среды, а также организме человека и животных. Для их определения в различных типах природных вод, грунто-пылевых смесях, плазме крови и моче человека и животных применяли быстрые способы пробоподготовки в сочетании с обращенно-фазовой жидкостной хроматографией, гидрофильной хроматографией, анионообменной жидкостной хроматографией, дериватизацией и тандемной масс-спектрометрией. Достигнутые пределы обнаружения (от 0.005 нг/мл до 4 нг/мл) в различных объектах позволяют проводить надежное установление факта применения химического оружия на ультранизких уровнях концентраций. Достоверность разработанных способов была подтверждена при анализе реальных объектов, содержащих продукты деградации НПОВ, а также в ходе официальных тестов, проводимых лабораторией по запрещению химического оружия.

Разработаны новые подходы для определения продуктов окислительной трансформации нервно-паралитических отравляющих веществ.
Одним из малоизученных классов соединений, присутствие которых косвенно указывает на факт применения, хранения, производства и переработки высокотоксичных фосфорорганических НПОВ, также являются 2-(N,N-диалкиламино)-этансульфоновые кислоты (диалкилтаурины) – замещенные производные таурина. В отличие от таурина, 2-(N,N-диалкиламино)-этансульфоновые кислоты в природе не встречаются, а являются продуктами окислительной трансформации т.н. V-газов - фосфорорганических веществ, иcпользуемых в качестве нервно-паралитических отравляющих веществ. При помощи метода капиллярного электрофореза с ультрафиолетовым детектированием (КЭ-УФ) был разработан метод быстрого скрининга природных вод на содержание диалкилтауринов, а с помощью метода обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием был разработан высокочувствительный способ определения их содержания на низких уровнях концентраций (от 15 до 25 нг/мл).
При определенном значении pH от 7 до 10, VX и VR могут гидролизоваться в окружающей среде до S-(2-диэтиламиноэтил) метилфосфонотиоата (ДЭМФ), S-(2-диизопропиламиноэтил) метилфосфонотиоата (ДПМФ), бис(2-N,N-диэтиламиноэтил)дисульфида (ДЭАС) и бис(2-N,N-диизопропиламиноэтил)дисульфида (ДПАС) в водных объектах окружающей среды.

В ходе работы выполнена оптимизация условий масс-спектрометрического детектирования (выбор оптимальных пар ионных реакций) и программы градиентного элюирования при разделении веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложенный подход опробован при анализе реальных водных объектов методом «введено-найдено» и показал хорошую точность, воспроизводимость и селективность определения. Так, показано отсутствие мешающего влияния компонентов матрицы в пробах вод. В условиях предложенного подхода методом ВЭЖХ-МС/МС пределы обнаружения ДЭМФ, ДПМФ, ДЭАС и ДПАС в водных объектах составили, соответственно, 0.0003, 0.003, 0.3 и 0.05 мкг/мл.

Сернистый иприт является одним из наиболее старых и широкоизвестных боевых отравляющих веществ. Поступивший в организм человека или теплокровных животных иприт быстро подвергается процессам быстрой биохимической деградации. Для достоверного обнаружения факта экспозиции ипритом целесообразно определение известных продуктов трансформации– 1,1-сульфонилбис[2-S-(N-ацетилцистеинил) этана] (СБАЦЭ), 1,1'-сульфонилбис-[2-(метилсульфинил)этана] (СБМСЭ) и 1-метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этана (МСМТЭСЭ), а также тиодигликолиевой кислоты (ТДГК). Данные вещества образуются при взаимодействии иприта с белками в присутствии β-лиазы и содержатся в значительных количествах в биожидкостях организмов, отравленных ипритом. С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием в природных водах и моче человека были достигнуты очень низкие пределы обнаружения для маркеров применения иприта в диапазоне от 0.05 до 10 нг/мл. Для некоторых маркеров разработанные способы ВЭЖХ-МС определения были представлены впервые в литературе.

Разработаны новые подходы для определения продуктов трансформации иприта.
Сернистый иприт является одним из наиболее старых и широкоизвестных боевых отравляющих веществ. Поступивший в организм человека или теплокровных животных иприт быстро подвергается процессам быстрой биохимической деградации. Для достоверного обнаружения факта экспозиции ипритом целесообразно определение известных продуктов трансформации– 1,1-сульфонилбис[2-S-(N-ацетилцистеинил) этана] (СБАЦЭ), 1,1'-сульфонилбис-[2-(метилсульфинил)этана] (СБМСЭ) и 1-метилсульфинил-2-[2-(метилтио)этилсульфонил]этана (МСМТЭСЭ), а также тиодигликолиевой кислоты (ТДГК). Данные вещества образуются при взаимодействии иприта с белками в присутствии β-лиазы и содержатся в значительных количествах в биожидкостях организмов, отравленных ипритом. С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием в природных водах и моче человека были достигнуты очень низкие пределы обнаружения для маркеров применения иприта в диапазоне от 0.05 до 10 нг/мл. Для некоторых маркеров разработанные способы ВЭЖХ-МС определения были представлены впервые в литературе.

Разработаны новые подходы для определения продуктов трансформации люизита.
Хлорвиниларсины (люизиты) представляют из себя сложную смесь веществ, которая содержит и цис-, и транс-изомеры. Люизит-1 (2 – хлорвинилдихлорарсин, Л-1) относится к классу кожно-нарывных отравляющих веществ; он вступает в реакции с некоторыми активными центрами ферментов. Люизит-2 (бис-(β-хлорвинил)хлорарсин, Л-2) и люизит-3 (трис-(хлорвинил)хлорарсин, Л-3) также являются токсичными веществами, но в меньшей степени нежели Л-1. Для определения продуктов гидролиза люизита – хлорвиниларсонистой кислоты (ХВАК) и хлорвиниларсоновой кислоты (ХВАОК) применяли методы капиллярного электрофореза с УФ детектированием и высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Разработанный КЭ-УФ способ определения ХВАК и ХВАОК является скрининговым и может быть использован для быстрой оценки заражения объектов окружающей среды люизитом. Разработанный ВЭЖХ-МС способ позволяет проводить более надежное и высокочувствительное обнаружение ХВАК и ХВАОК на ультра-низких уровнях концентраций (0.5-3 нг/мл).

Разработаны новые подходы для идентификации и определения компонентов растительного сырья.
Для целевого определения физиологически активных компонентов растений были выбраны условия экстрагирования, неразрушающие целевые соединения и обеспечивающие высокие степени извлечения, а также подобраны условия хроматомасс-спектрометрического детектирования, позволяющие достичь низких пределов обнаружения. Для определения салидразида, розавина, розарина из родиолы розовой, псевдогинсенозидов F11 и RT5 из американского женьшеня, схизандролов А и В из лимонника китайского, байкалина, байкалеина, вогонина, скутелларина из шлемника байкальского, а также глицирризина из корней солодки использовали режим мониторинга выбранных реакций, обеспечивающий достижение низких пределов обнаружения выбранных соединений в диапазоне от 1 до 20 нг/мл. Гинсенозиды Rb1, Rg1, Rf и Re не образовывали стабильных фрагментных ионов из депротонированных молекул при диссоциации, активированной соударениями, и не способны образовывать протонированных молекул в режиме регистрации положительных ионов, однако в масс-спектрах данных соединений при использовании линейной ионной ловушки наблюдаются характерные паттерны фрагментации, содержащие группу интенсивных сигналов. Таким образом, для количественного анализа данных гинсенозидов был применен режим сканирования по сумме интенсивностей выбранных сигналов с использованием линейной ионной ловушки, который обеспечил возможность проведения одновременно идентификации и высокочувствительного определения данных соединений с пределами обнаружения в диапазоне от 3 до 10 нг/мл.

С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в линейной ионной ловушке были получены характерные паттерны фрагментации женьшеневых сапонинов и сапонинов, содержащихся в растениях рода Panax, листьях четочника молитвенного Abrus precatorius L. и корне солодки Glycyrrhiza glabra. Паттерны фрагментации, а также характерные времена удерживания сапонинов позволили провести групповую идентификацию гинсенозидов с протопанаксатриольным, протопанаксадиольным, октиллольным и олеаноловым кислтным сапогенинами, а также обнаружить присутствие группы абрусозидов из листьев четочника молитвенного и компонентов экстракта корня солодки в составе женьшеневого улуна, которые обуславливают сладкий привкус этого вида чая. Также с помощью препаративной хроматографии и применения методов ЯМР, масс-спектрометрии высокого разрешения и высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием была подтверждена структура нескольких новых соединений в экстракте из женьшеневого улуна.

Для количественной оценки содержания гинсенозидов, а также компонентов надземных частей растения T.terrestris, был успешно применен метод КАМС, позволяющий по найденным факторам пересчета относительно референтного соединения с известной концентрацией проводить количественный анализ без применения стандартных образцов. Полученные результаты могут быть использованы для проведения контроля качества широкого круга растительной продукции, изучения состава полезных растительных материалов, а также для создания лекарственных препаратов на основе идентифицированных физиологически активных компонентов.

Ненаправленное метаболомическое профилирование биожидкостей для установления потенциальных биомаркеров социально-значимых заболеваний.
С 2016 года, совместно с Государственным научным центром колопроктологии им. А.Н. Рыжих, в научной группе начаты работы по ненаправленному профилированию образцов мочи для выявления потенциальных биомаркеров колоректального рака. Изучены возможности и ограничения применения метода капиллярного электрофореза со спектрофотометрическим детектированием. Наиболее перспективным методом профилирования признан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.

Опробованы различные варианты пробоподготовки образцов, методы коррекции сигнала (эта операция необходима в связи с загрязнением ионной оптики детектора при анализе биожидкостей), варианты нормализации по экскреции метаболитов (что особенно актуально при анализе образцов мочи), оптимизирована длина аналитической последовательности (с точки зрения минимизации загрязнений аналитической колонки и масс-спектрометрического детектора), исследованы варианты обработки данных (масштабирование, фильтрация, трансформация, заполнение пропущенных значений и пр.), отработаны схема обработки масс-хроматограмм с помощью специального программного обеспечения (интегрирование, выравнивание по временам и массам, удаление шума, фильтрация, деконволюция и пр.) и способы проведения многомерного статистического анализа для выявления потенциальных биомаркеров методами PCA, o-PLS-DA, PLS-DA, sPLS-DA, случайный лес, кластерным анализом и тп.

Разработан новый подход для идентификации красителей рукописного штриха шариковой ручки.
Одной из центральных задач технико-криминалистического исследования документов является установление времени и последовательности изготовления реквизитов документа. Задача установления давности исполнения документа и его реквизитов может быть вызвана необходимостью проведения судебно-технической экспертизы документов в связи с расследованием уголовных дел, разрешением гражданско-правовых споров, либо в некоторых случаях при арбитражном рассмотрении дел или в ходе нотариального свидетельствования документов. Актуальная задача криминалистического исследования документов в настоящее время это определение давности исполнения записей такими распространенными средствами письма, как шариковые ручки. Для её решения требуется получить информацию о составе компонентов паст шариковых ручек, которыми исполнялись записи, а также о том, какие качественные и количественные изменения претерпели компоненты во времени после нанесения записей на документ.
С использованием метода прямого ввода анализируемого образца в масс-анализатор в потоке подвижной фазы выявлены характеристичные наборы ионов, отвечающих компонентам паст для 16 образцов шариковых ручек. Показано, что в ряде случаев возможно проведение предварительной дифференциации штрихов по виду масс-спектров их экстрактов. Проведена классификация паст шариковых ручек на 3 группы в соответствии с набором входящих в состав красителей.
В рамках работы проведено исследование процессов искусственного старения красителей при воздействии повышенных температур и УФ-излучения на штрихи исследуемых паст шариковых ручек BIC Original, Corvina 51 и Pilot. С увеличением времени внешнего воздействия наблюдалось видимое изменение содержания продуктов деградации относительно исходного красителя. Выявлены кинетические характеристики процессов деградации красителей, позволяющие предсказать характерные соотношения содержания красителей и их продуктов деградации. Техника воздействия УФ-излучения и повышенных температур на образцы может быть полезна для проведения дифференциации штрихов, отличающихся сроком нанесения или умышленно подвергнутых искусственному состариванию с помощью данных типов внешнего воздействия.